RESUMO: Nesta pesquisa avaliou-se o efeito do colesterol sobre o sêmen de garanhões da raça Nordestina sobre a qualidade espermática. Vinte ejaculados de dois garanhões foram diluídos com BotuSemen e colesterol carreado pela ciclodextrina (CCC) adicionado no sêmen: controle, 0,75mg de CCC e 1,0mg de CCC/120x106 sptz/mL, e incubado a 26°C/15min. O sêmen foi diluído 1:5 (v/v) com diluente Lactose-gema de ovo e resfriado a 5°C/2h, envasado em palhetas de 0,5mL, e acondicionado sob vapor de nitrogênio líquido, e depois imersos. As amostras foram descongeladas (37 °C/30s) e avaliadas. As variáveis foram avaliadas com ANOVA e teste de Tukey (P<0,05). A motilidade total e progressiva foi maior (P<0,05) no sêmen tratado com CCC comparado as amostras do grupo controle, e CCC promoveu maior percentual (P<0,05) de motilidade total e progressiva durante as 3 horas de incubação. A percentagem de espermatozoides com viabilidade e integridade foi maior (P<0,05) no sêmen tratado com CCC (81,47 e 86,07%) comparado ao controle (72,12 e 70,19%). O número de espermatozoides reativos ao teste hiposmótico foi maior (P<0,05) nas amostras de sêmen tratadas com CCC comparado ao controle. Adição de colesterol no sêmen de garanhões Nordestino melhora a qualidade espermática apos a criopreservação.

ABSTRACT: In the study effect of cholesterol was evaluated on the sperm quality of Nordestina stallion breed. Twenty semen samples were used from two stallions, diluted with BotuSemen extender and cholesterol add as follows: control, 0.75mg of cholesterol-loaded cyclodextrin (CLC) and 1.0mg of CLC/120x106 sperm/mL, and incubated for 15 min at 22°C. The samples were diluted 1:5 with lactose-yolk egg extender and cooled to 5°C over two hours, loaded into 0.5mL straws and frozen in static liquid nitrogen vapor before being plunged into nitrogen. Samples were thawed (37°C/30s) and analyzed. The variables were analyzed by ANOVA and means compared by Tukey test (P<0.05). Higher percentages of total and progressive motile was higher for sperm treated with CLC compared to control, and CLC promoted higher percentages (P<0.05) of total and progressive motility for the 3 hours of incubation. The percentage of viability and plasma membrane integrity of spermatozoa were higher (P<0.05) in sperm treated with CLC compared to the control group. The number of spermatozoa reacted to hypoosmotic test was higher (P<0.05) in sperm treated with CLC than control. Addition of CLC in the semen of Nordestina stallion breed improve the sperm quality after cryopreservation.

RESUMO: Objetivou-se avaliar o efeito da adição dos antioxidantes ácido ascórbico, melatonina e Trolox C, associados ao sêmen diluído de carneiros sobre o estresse oxidativo e o potencial fecundante após criopreservação. Foram coletados 10 ejaculados de 3 carneiros (n=30) e diluídos em Tris-Gema de ovo até a concentração final de 200x106 sptz/mL e, mantidos em banho maria a 32°C. Os antioxidantes foram adicionados da seguinte forma: controle (sem adição de antioxidantes); 100μM de melatonina (MEL) + 0,05% de ácido ascórbico (AA); 100μM de MEL + 90μL de Trolox C (TRO); 90μL de TRO + 0,05% de AA; e 100μM de MEL + 0,05%AA + 90μL de TRO. Depois, o sêmen foi resfriado em câmara fria a 5°C por duas horas, após esse período, envasado e lacrado em palhetas de 0,5mL, e então acondicionado sob vapor de nitrogênio liquido (N2L), a 8cm da lâmina líquida por 15 minutos, e depois imersos no N2L. As amostras foram analisadas quanto à motilidade espermática, integridade da membrana plasmática e da membrana acrossomal, atividade mitocondrial, teste de ligação e a quantificação do estresse oxidativo. As variáveis foram submetidas à análise de variância e medias comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. A motilidade (total e progressiva) foi maior (P<0,05) quando adicionado à associação MEL+AA+TRO (67% e 49,89%), MEL+AA (64,37% e 45,61%) e MEL+TRO (61,65% e 41,15%) comparado ao tratamento controle (55,52% e 36,54%) e TRO+AA (57,07% e 38,40%). A adição de MEL+AA+TRO ao sêmen diluído manteve (P<0,05) a integridade da membrana plasmática (30,75%) e acrossomal (84,53%) dos espermatozoides quando comparado ao tratamento controle (15,60 e 68,16%, respectivamente), além de ter promovido maior (P<0,05) atividade mitocondrial (96,43%) quando comparado aos demais tratamentos. O número de espermatozoides que apresentaram à capacidade de ligação a membrana perivitelina da gema de ovo foi maior (P<0,05) no sêmen tratado com as diferentes associações de antioxidante quando comparado ao controle, sendo a associação MEL+AA+TRO (178,36%) superior (P<0,05) aos demais tratamentos. Não houve diferença (P>0,05) entre os tratamentos quanto a quantidade de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico produzidos. Conclui-se que a adição de MEL+AA+TRO ao sêmen diluído de carneiros, nas doses avaliadas, melhora a qualidade espermática após descongelação.

ABSTRACT: Aimed to evaluate the effect of adding antioxidants as ascorbic acid, melatonin and Trolox C to diluted semen of ram with oxidative stress to potenciate fertilization after cryopreservation. Ten samples collected were diluted in Tris-egg yolk to a final concentration of 200x106 sperm/mL and kept in a water bath at 32°C. Antioxidants were added as follows: 100μM melatonin (MEL) +.05% ascorbic acid (AA); 100μM of MEL + 90μL of Trolox C (TRO); 90μL of TRO + 0.05% AA; and 100μM of MEL0.05% AA + 90μL of TRO. Semen was cooled in a cold chamber at 5°C for two hours and packaged, sealed in 0.5mL straws, packaged under liquid nitrogen vapor (N2L), 8cm of water depth for 15 minutes, and then immersed in N2L. Samples were assayed for motility, integrity of the plasma membrane and acrosomal membrane, mitochondrial activity, binding assay and oxidative stress spermatozoa. The variables were analyzed by ANOVA and means compared by Tukey test (P<0.05). Percentage of total and progressive motility was higher for sperm treated with MEL+AA+TRO (67% and 49.89%), MEL+AA (64.37% and 45.61%) and MEL+TRO (61.65% and 41.15%) compared with the other treatments (P<0.05). The integrity of the plasma membrane and acrosome was higher for all semen treated with antioxidant associations compared with control (P<0.05). Mitochondrial activity was higher in sperm treated with MEL+AA+TRO compared all treatments (P<0.05). The number of sperm binding to perivitelline membrane was higher for semen treated with antioxidant associations compared with control; also sperm treated with MEL+AA+TRO demonstrated higher effect of all (P<0.05). No difference was observed between the treatments by oxidative stress sperm (P>0.05). The addition of melatonin, ascorbic acid and Trolox C in diluted semen of ram improves sperm quality after thawing.

Resumo: Objetivou-se avaliar o efeito da adição de diferentes concentrações de melatonina no sêmen diluído de carneiros após criopreservação. Foram coletados 10 ejaculados de três carneiros adultos (n=30), por meio de vagina artificial para ovinos. Os ejaculados coletados foram diluídos em Tris-Gema de ovo, para a concentração final de 200x106 sptz/mL, mantidos em banho maria a 32°C, e a melatonina adicionada conforme os tratamentos: Controle; 100pM; 100nM; 100μM e 1mM de melatonina. Então, as amostras foram resfriadas em câmara fria a 5°C por duas horas, envasadas em palhetas de 0,5 mL e lacradas. Logo após, foram acondicionadas sob vapores do nitrogênio liquido, por 15 minutos, a 8cm da lâmina líquida e congeladas com nitrogênio líquido. As amostras foram analisadas quanto à motilidade espermática, integridade da membrana plasmática, membrana acrossomal, atividade mitocondrial, quantificação do estresse oxidativo e a capacidade de ligação. As variáveis foram submetidas à análise de variância e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. A motilidade total e progressiva dos espermatozoides descongelados foi maior nas amostras tratadas com 100pM de melatonina (62,99 e 45,07% respectivamente; P<0,05) quando comparado aos demais tratamentos. A adição das diferentes concentrações de melatonina no sêmen diluído, com exceção da concentração de 1 mM, apresentou maior percentual de células com membrana plasmática íntegra, quando comparadas com o controle (P<0,05). O percentual de espermatozoides com integridade da membrana do acrossoma foi maior no sêmen tratado com 100 pM de melatonina (P<0,05) do que nos demais tratamentos. A alta atividade mitocondrial foi maior nos espermatozoides tratados com 100 pM de melatonina (69,30%; P<0,05). A adição de 100 nM de melatonina reduziu a quantidade de TBARS após a criopreservação (2,84; P<0,05) quando comparado aos demais tratamentos. Após o descongelamento, o número de espermatozoides que se ligaram à membrana perivitelina foi maior nos tratados com 100 pM de melatonina (155,73; P<0,05). Portanto, a adição de melatonina no sêmen diluído pode ser útil para aperfeiçoar a criopreservação do sêmen de ovinos, melhorando as taxas de fertilização por meio da inseminação artificial.

Abstract: The aim was to evaluate the effect of adding different concentrations of melatonin in ram semen diluted after cryopreservation. Ten ejaculates were collected0 from three adult ram (n=30) by means of artificial vagina for sheep. The collected samples were diluted in Tris-egg yolk, to a final concentration 200x106 sptz/mL kept in water bath at 32°C, and melatonin added as treatments: control; 100pM; 100nM; 100μM and 1mM melatonin. Then, the samples were cooled in a cold chamber at 5°C for two hours, in straws of 0.5mL and sealed. They were stored under the liquid nitrogen vapor for 15 minutes to 8cm of liquid blade and frozen with liquid nitrogen. Samples were analyzed for sperm motility, membrane integrity, acrosomal membrane, mitochondrial activity, oxidative stress and quantification of the binding capacity. The variables were subjected to analysis of variance and the means were compared by Tukey test at 5% probability. The total and progressive motility of thawed sperm were higher in samples treated with 100pM melatonin (62.99 and 45.07%, respectively; P<0.05) when compared to other treatments. The addition of different concentrations of melatonin in semen diluted with the exception of 1mM concentration, a higher percentage of cells with intact plasma membrane, as compared with the control (P<0.05). The percentage of sperm with acrosome membrane integrity was higher in the semen with 100pM melatonin (P<0.05) than the other treatments. The high mitochondrial activity was higher in spermatozoa treated with 100pM melatonin (69.30%; P<0.05). Addition of 100nM melatonin reduced the amount of TBARS after cryopreservation (2.84, P<0.05) when compared with the other treatments. After thawing, the number of sperm which bind to the perivitelline membrane was higher in the melatonin treated with 100pM (155,73; P<0.05). Therefore, melatonin addition the semen diluted can be useful to enhance the cryopreservation of sheep semen, improving fertilization rates through artificial insemination.

RESUMO: Este estudo descreveu as características seminais, da membrana plasmática e do acrossoma de espermatozoide congelado/descongelado de 19 ejaculados de garanhões da raça Nordestina. Os aspectos analisados incluíram os parâmetros físicos do sêmen fresco; a motilidade e a longevidade do sêmen diluído e descongelado; a morfologia espermática, integridade funcional e estrutural da membrana plasmática do espermatozoide e a habilidade de ligação do espermatozoide à membrana perivitelina da gema do ovo de galinha do sêmen descongelado. As variáveis foram avaliadas pela ANOVA com post hoc teste de Student Newman-Keuls (P<0,05). A MT e a MP foram maiores (P<0,05) no sêmen diluído do que no descongelado. A percentagem média de defeitos maiores, menores e totais foi muito inferior ao limite recomendado pelo CBRA. A porcentagem de reativos ao HOST foi de 14,21±1,12% e a porcentagem média de membranas íntegras detectadas pelo teste supravital de 62,22±9,06% e pela sonda SYBR-14 de 81,47±26,90. O número médio de espermatozoides ligados à MPV após a descongelação do sêmen foi de 230,39±57,09. A MT e MP no tempo 0 min do TTR foi superior (P<0,05) em relação a 150 min, não diferindo nos tempos 10 min e 30 min. Os resultados demonstram que a utilização dos testes laboratoriais adicionais ajudam no processo de avaliação das amostras, possibilitando a obtenção de informações mais confiáveis e precisas. Embora a criopreservação tenha provocado queda na motilidade seminal, o uso de diluidor contendo amidas minimizou os danos osmóticos nas células espermáticas e manteve a integridade morfológica, funcional e estrutural da membrana plasmática do espermatozoide. Estes resultados são um referencial em estudos futuros uma vez que, inexistem dados comparativos nesta raça.

ABSTRACT: This paper describes the seminal characteristics of the plasma membrane of frozen-thawed sperm. Nineteen ejaculates of Nordestino horse breed. The aspects analyzed in the physical parameters of fresh semen were total and progressive motility and your longevity after dilution or thawed; sperm morphology, functional and structural integrity of the plasma membrane of the sperm and the sperm-binding ability to the perivitelline membrane of the yolk (MPV) after thawed. The variables were assessed by ANOVA with post hoc test of Student Newman-Keuls test (P<0.05). The total and progressive motility were higher in diluted semen than thawed (P<0.05). The average percentage of the major, minor and total defects was lower than the limit recommended by the CBRA. The percentage of reactive to hypo-osmotic swelling test was 14.21±1.12%, the intact membrane detected by supravitally test was 62.22±9.06% and the SYBR-14 was 81.47±26.9. The ability of sperm to bind to the MPV after thawing semen was 230.39±57.09. The total and progressive motility at time 0 min of termo resistance test was higher than to 150 minutes (P<0.05), and no difference was observed in the times 10 and 30 minutes. The results demonstrate that the use of additional laboratory tests help in the process of evaluation of samples, making possible to obtain more reliable and accurate information. Although cryopreservation has caused decrease in sperm motility and was used diluents with amides to diluted and cryopreservation protocol and this minimized the osmotic damage to sperm cells and maintained the morphological, functional and structural integrity of the plasma membrane of the sperm. These results are a reference for future studies since there are no comparative data on this breed.